Автоклав для микробиологической лаборатории: среды, посуда, отходы и типовой комплект

Что делает автоклав в микробиологической лаборатории

Микробиологическая лаборатория работает с живыми микроорганизмами: выделяет их из проб, выращивает, идентифицирует, определяет чувствительность к антибиотикам, хранит музейные штаммы. Каждый этап требует стерильности на входе и безопасности на выходе. Среда, в которую сеют пробу, должна быть свободна от посторонней микрофлоры, иначе результат анализа ничего не стоит. Посуда, петли, наконечники и пробирки должны быть стерильны. А всё, что побывало в контакте с культурой, — чашки Петри с выросшими колониями, пробирки, пипетки, перчатки, остатки проб — перед выносом за пределы лаборатории должно быть обеззаражено.

Все три задачи решает паровая стерилизация. Насыщенный пар под давлением конденсируется на холодных поверхностях загрузки, отдаёт скрытую теплоту и прогревает её до температуры, при которой гибнут вегетативные клетки и споры. Сухой горячий воздух делает то же медленнее и при более высокой температуре, химические средства не проникают в толщу питательной среды и в плотные пакеты с отходами. Поэтому автоклав для микробиологической лаборатории — не одна из позиций в списке оборудования, а прибор, без которого лаборатория не начнёт работу. Как устроен автоклав и чем пар отличается от горячего воздуха, подробно описано в статье что такое автоклав и как он работает.

Три вида загрузки и три логики программы

Задачи различаются не только назначением, но и физикой процесса. Питательная среда — это жидкость в ёмкостях: её нужно прогреть насквозь, не перегреть и остудить так, чтобы она не вскипела при сбросе давления. Посуда и инструменты — твёрдые изделия, часто в упаковке: здесь главное — вытеснить воздух из пакетов и полостей и высушить загрузку после цикла. Отходы — смешанная загрузка в пакетах и контейнерах: пластик, агар, жидкость, бумага; в ней много воздуха и много влаги, а прогреть её до центра труднее всего. Поэтому у хорошего лабораторного автоклава несколько программ, и выбирают прибор под ту задачу, которая в лаборатории самая тяжёлая.

Бактериологическая, санитарная и ПЦР-лаборатория

Автоклав для бактериологической лаборатории клинико-диагностического профиля, лаборатории санитарной микробиологии (пищевой, водной, ветеринарной) и лаборатории молекулярной диагностики выбирают по-разному. Бактериологическая лаборатория готовит много сред и выдаёт много отходов с выросшими культурами. Санитарная лаборатория работает с большим числом проб пищевых продуктов и воды; её особенности разобраны в статье автоклав в лаборатории контроля качества. ПЦР-лаборатория сред почти не готовит, зато должна обеззараживать отработанный материал и пробы, не нарушая зонирования. Ниже разберём каждую задачу и затем соберём типовые комплекты.

Чистый и грязный автоклав: зачем разделять

В микробиологии принято различать «чистый» автоклав, в котором стерилизуют то, что пойдёт в работу (среды, посуду, инструменты), и «грязный», в котором обеззараживают отработанный материал перед утилизацией или мойкой. Смысл разделения прост: в одной камере не должны встречаться стерильное и заражённое. Если в автоклаве только что обеззараживали пакеты с культурами, на стенках, в сливе и в баке может остаться загрязнение; если же в камере обеззараживания стоит стерильная среда, любой сбой цикла испортит и её, и результаты посевов.

Два автоклава или один

Самый надёжный вариант — два прибора: чистый стоит в зоне приготовления сред и подготовки посуды, грязный — в зоне обеззараживания, ближе к выходу отходов. Там, где поток небольшой и второй прибор не помещается, работают одним автоклавом, но разделяют его использование: отдельные циклы для чистого и грязного, разные дни или смены, раздельные места хранения до и после цикла, отметки в журнале. Порядок обращения с материалом, содержащим микроорганизмы, и требования к обеззараживанию устанавливают санитарные правила СанПиН 3.3686-21; внутренний порядок лаборатория закрепляет в своих инструкциях.

Проходной автоклав в стене

Высшая ступень разделения — проходной автоклав с двумя дверями, встроенный в стену между зонами. Его загружают с грязной стороны, а выгружают с чистой, и двери не открываются одновременно. В лабораториях, работающих с возбудителями высоких групп патогенности, и в крупных лабораториях с барьерной зоной проходной стерилизатор позволяет вынести обеззараженный материал, не нарушая границы. В каталоге КАДАММ проходные модели — это КАДАММ СП-Г24 и КАДАММ СП-Г25 со встроенным парогенератором (камеры 146–352 л и 352–999 л) и КАДАММ СП-Г26, КАДАММ СП-Г27 от внешнего пара; все они собраны в разделе проходные автоклавы.

Стерилизация питательных сред в микробиологии

Стерилизация питательных сред в микробиологии — самая требовательная к автоклаву задача. Среда должна стать стерильной, но сохранить ростовые свойства: перегрев разрушает витамины, вызывает карамелизацию сахаров и реакцию между сахарами и аминокислотами, смещает pH. Недогрев оставляет в среде споры, которые прорастут в термостате и дадут ложный рост. Между этими ошибками и лежит рабочий режим, который берут из инструкции к сухой среде и подтверждают в своей лаборатории. Общие требования к приготовлению и контролю сред для пищевой и санитарной микробиологии описывает ГОСТ ISO 11133.

Режим и время выдержки

Основной режим для сред — 121 °C. Время выдержки зависит от объёма одной ёмкости: пробирка прогревается за минуты, литровая бутыль — заметно дольше. Датчик автоклава показывает температуру пара в камере, а не в жидкости, поэтому для крупных ёмкостей время увеличивают и проверяют контрольным датчиком в эталонной бутыли с водой того же объёма. Среды с сахарами, желчью и другими термочувствительными компонентами часто стерилизуют при пониженной температуре по инструкции производителя. Режим 134 °C для жидкостей не применяют: он рассчитан на стекло и металл с короткой выдержкой. Подробный разбор режимов — в статье режимы стерилизации в автоклаве.

Программа для жидкостей и сброс давления

После выдержки жидкость в ёмкостях горячее точки кипения при атмосферном давлении. Если сбросить давление быстро, среда вскипает, выплёскивается из флаконов, пробки выбивает, а бутыли могут лопнуть. Поэтому для сред нужна программа с медленным сбросом давления и охлаждением камеры до безопасной температуры перед открытием двери. Сушка средам не нужна: она только выпаривает воду. Если в автоклаве есть только режим с быстрым выпуском пара, для сред он неудобен.

Растапливание и поддержание агара

Готовый агар часто нужно растопить и держать жидким до разлива по чашкам. Удобно, когда автоклав позволяет задать низкую температуру и удерживать её после цикла. В каталоге КАДАММ широкий диапазон уставок есть, например, у вертикальных КАДАММ СП-В13 (40–138 °C) и КАДАММ СП-В22 (50–134 °C), у горизонтальных КАДАММ СП-Г7 (40–134 °C). Если такой функции нет, агар растапливают в водяной бане, но не повторным полным циклом стерилизации: повторное автоклавирование ухудшает среду. Вся технология — подготовка флаконов, укупорка, загрузка, ошибки — разобрана в статье стерилизация питательных сред в автоклаве.

Какой автоклав удобен для сред

Для сред хорош вертикальный автоклав: бутыли и флаконы стоят в корзинах устойчиво, камера вмещает высокие ёмкости, а точность и равномерность температуры позволяют выдерживать режим без перегрева. В лаборатории с небольшим потоком сред справляется настольный прибор с регулировкой температуры; в крупной — вертикальный на 100–150 л или горизонтальный с тележкой. Важно не путать объём камеры с объёмом среды: камера на 50 л вмещает заметно меньше жидкости, потому что ёмкости заполняют не больше чем на две трети и ставят с зазором для пара.

Посуда, инструменты и расходные материалы

Вторая задача чистого автоклава — стерилизация того, что соприкасается с посевом: пипеток, наконечников в штативах, пробирок, колб, бактериологических петель и шпателей, фильтровальных установок, халатов и салфеток для бокса. Здесь режим чаще 121 °C или 134 °C, а главный вопрос — удаление воздуха.

Почему воздух мешает стерилизации

Воздух тяжелее пара и не конденсируется. Если он остался в упаковке, в узком горлышке, внутри наконечника или в стопке ткани, пар туда не дойдёт, и в этом месте температура будет ниже, чем показывает датчик. Неупакованная открытая посуда в автоклаве с гравитационным вытеснением воздуха стерилизуется нормально: пар вытесняет воздух вниз, в слив. Упакованные изделия, пористые материалы и изделия с полостями требуют предварительного вакуума: камера несколько раз откачивается и заполняется паром, и воздух удаляется из всей загрузки. Как это связано с классами B, N и S, рассказано в статье классы автоклавов B, N и S.

Сушка

Упакованная посуда, выгруженная мокрой, перестаёт быть стерильной: влажная бумага и ткань пропускают микроорганизмы. Поэтому для изделий в упаковке нужна сушка, лучше вакуумная: после стерилизации камера откачивается, вода выкипает при пониженном давлении и уходит с паром. У вертикальных КАДАММ СП-В34 и горизонтальных КАДАММ СП-Г9 предельный вакуум −0,096 МПа и вакуумная сушка 15 мин; у КАДАММ СП-В31 время сушки задаётся в диапазоне 0–240 мин. Для открытой стеклянной посуды достаточно сушки без вакуума или сушильного шкафа после цикла.

Сухожар или автоклав

Стеклянную посуду и металлические инструменты можно стерилизовать и сухим горячим воздухом. Воздушный стерилизатор не даёт влаги и не требует воды и слива, но работает при более высокой температуре и дольше, а пластик, ткань, жидкости и резину в нём обрабатывать нельзя. Во многих лабораториях держат и то и другое: стекло и металл — в воздушном стерилизаторе, всё остальное — в автоклаве, а мытую посуду перед упаковкой сушат в лабораторном сушильном шкафу.

Обеззараживание отходов микробиологической лаборатории

Обеззараживание отходов микробиологической лаборатории — задача грязного автоклава и самая важная с точки зрения безопасности. Чашки с выросшими колониями, пробирки с культурами, остатки проб, одноразовые наконечники, перчатки — всё это содержит живые микроорганизмы в высокой концентрации. Санитарные правила СанПиН 2.1.3684-21 относят отходы микробиологических лабораторий, работающих с микроорганизмами III–IV групп патогенности, к классу Б, а работающих с I–II группами — к классу В. Для таких отходов требуется обеззараживание, и в лаборатории его обычно проводят в автоклаве до выноса за пределы подразделения. Как классы связаны со сбором, тарой и маркировкой, разобрано в статье классы отходов А, Б, В, Г и Д.

Почему отходы стерилизовать труднее, чем среды

Пакет с отходами — плотная смесь пластика, агара, жидкости и воздуха. Пластиковые чашки, сложенные стопкой, образуют воздушные карманы; агар долго прогревается; пакет, завязанный плотно, не пускает пар внутрь. Поэтому программы обеззараживания длиннее программ для посуды, а загрузку готовят особым образом: пакеты не завязывают туго или оставляют открытыми в жёстком контейнере, в пакет с сухими отходами добавляют немного воды, чтобы внутри образовался пар, контейнеры ставят с зазором. Предварительный вакуум помогает удалить воздух из глубины загрузки, и для крупных потоков отходов он особенно полезен. Порядок загрузки и режимы — в статье обеззараживание лабораторных отходов в автоклаве.

Пакеты и контейнеры для автоклава

Отходы собирают в термостойкие пакеты, рассчитанные на автоклавирование, и ставят их в жёсткие лотки или контейнеры, чтобы расплавленный агар и жидкость не попали на дно камеры. Острые предметы — в непрокалываемые контейнеры. Обычный полиэтиленовый мешок для мусора в автоклаве плавится и забивает слив. Подходящие пакеты, мешки и контейнеры подобраны в разделах пакеты и мешки для опасных отходов и контейнеры для отходов класса Б и В.

Конденсат и выхлоп

При обеззараживании культур из камеры выходят воздух и пар, которые на первых этапах цикла ещё не прогреты до температуры гибели микроорганизмов. Если сбрасывать их в атмосферу помещения или в канализацию без обработки, возбудитель может выйти из автоклава раньше, чем погибнет. Поэтому в грязном автоклаве ценятся сбор конденсата и фильтрация выхлопа. В каталоге КАДАММ такое исполнение — вертикальный КАДАММ СП-В35 на 50–120 л с рабочей температурой 134 °C и давлением 0,23 МПа: конденсат собирается, выхлоп проходит через фильтр. Для больших потоков подходят горизонтальные автоклавы с вакуумом, например КАДАММ СП-Г9 на 60–450 л или КАДАММ СП-Г12 на 150–800 л.

Сколько отходов выходит за день

Объём грязного автоклава считают по суточному потоку отходов, а не по объёму чистого автоклава. Соберите пакеты за обычный рабочий день, сложите их в лотки и посмотрите, сколько циклов нужно камере выбранного объёма с учётом того, что загрузку ставят свободно. Если циклов получается больше двух-трёх в день, лучше взять прибор крупнее: длинные программы обеззараживания плохо помещаются в смену, а отходы, стоящие в очереди, — лишний риск.

Автоклав для ПЦР-лаборатории

Автоклав для ПЦР-лаборатории решает другую задачу, чем в бактериологии. Лаборатория молекулярной диагностики почти не готовит питательных сред и не выращивает культуры, но работает с пробами, которые могут содержать живые возбудители, и обязана обеззараживать отработанный материал. Порядок работы таких лабораторий с материалом, содержащим микроорганизмы I–IV групп патогенности, описывают методические указания МУ 1.3.2569-09.

Зоны ПЦР-лаборатории и маршрут отходов

ПЦР-лаборатория разделена на зоны: приём и обработка проб, выделение нуклеиновых кислот, приготовление реакционных смесей, амплификация и детекция. Главный риск — не живые микроорганизмы, а продукты амплификации: если они попадут в зону приготовления реакций, лаборатория начнёт получать ложноположительные результаты. Поэтому отходы из зоны детекции никогда не проносят через «чистые» зоны, а оборудование и халаты за зонами закрепляют. Автоклав ставят так, чтобы отходы из каждой зоны попадали к нему, не пересекая чужие помещения, — чаще всего в отдельной автоклавной или в зоне обработки проб.

Чего автоклав в ПЦР не делает

Важно понимать границы метода. Автоклавирование надёжно убивает микроорганизмы, но не гарантирует разрушения нуклеиновых кислот до состояния, в котором они не дают сигнала в реакции. От контаминации ампликонами и чужой ДНК защищают зонирование, однонаправленный поток, ультрафиолет, растворы, разрушающие нуклеиновые кислоты, и работа в ПЦР-боксе. Поэтому автоклав в ПЦР-лаборатории — инструмент биологической безопасности, а не средство очистки рабочих мест от ДНК. Подробно об организации работы — в статье ПЦР-бокс: как организовать работу без загрязнения проб; сами боксы — в разделе ПЦР-боксы.

Какой объём нужен ПЦР-лаборатории

Поток отходов ПЦР-лаборатории — пробирки, наконечники, штативы, перчатки — обычно меньше, чем у бактериологической лаборатории того же масштаба, и плотнее упакован. Для небольшой лаборатории подходит настольный автоклав класса B с импульсным вакуумом: КАДАММ СП-Н13 с камерой 35–90 л или КАДАММ СП-Н18 на 45–80 л с автоматической дверью. При большом числе исследований — вертикальный КАДАММ СП-В35 со сбором конденсата и фильтрацией выхлопа. Если лаборатория дополнительно стерилизует наконечники и пробирки собственного разлива, это делают в другом приборе или в отдельные циклы.

Где поставить автоклав

Автоклав — сосуд под давлением с нагревом, паром, водой и сливом. Выбор места влияет и на безопасность, и на удобство работы, и на то, какой прибор вообще получится поставить.

Автоклавная или рабочее помещение

Крупные вертикальные и горизонтальные автоклавы ставят в отдельное помещение — автоклавную — с вентиляцией, подводом воды, канализацией и электропитанием нужной мощности. Настольные модели часто стоят прямо в лаборатории, на прочном столе, рядом с раковиной. Для грязного автоклава важно, чтобы путь от рабочих мест к нему был коротким и не пересекал чистые зоны; для чистого — чтобы он стоял рядом с зоной приготовления сред и упаковки посуды. Требования к помещению, подключению, освидетельствованию и обслуживанию разобраны в статье установка и обслуживание автоклава.

Электропитание, вода и пар

Настольные и вертикальные автоклавы КАДАММ в большинстве работают от однофазной сети ~220 В: у КАДАММ СП-В1 мощность нагрева 4 кВт, у КАДАММ СП-В10 — 4,4–6 кВт. Горизонтальные модели с электрическим парогенератором потребляют больше и подключаются к трёхфазной сети: у КАДАММ СП-Г3 и КАДАММ СП-Г5 мощность 9–18 кВт при 380 В. Если в здании есть централизованный пар, удобнее модели от внешнего пара — КАДАММ СП-Г15 (давление внешнего пара 0,3–0,7 МПа) или КАДАММ СП-Г22: электрическая мощность у них идёт только на автоматику и насос. Вода для парогенератора должна быть подготовленной: жёсткая вода образует накипь на ТЭНах и в трубках.

Нагрузка на пол и проёмы

Масса крупного горизонтального автоклава исчисляется сотнями килограммов, а с водой — больше. Проверьте нагрузку на перекрытие, ширину дверных проёмов и лифтов, место для обслуживания сзади и сбоку. Для проходного автоклава заранее готовят проём в стене между зонами и согласуют его с проектом помещения.

Как выбрать автоклав для микробиологической лаборатории

Выбор начинают не с каталога, а с описания работы: что и сколько стерилизуют за день, в каких ёмкостях, есть ли упакованные изделия, сколько отходов, сколько человек загружает прибор, есть ли отдельная автоклавная. Общий порядок выбора — объём, вид, удаление воздуха, сушка, подключение — изложен в статье как выбрать лабораторный автоклав. Здесь — то, что важно именно микробиологу.

Объём и вид

Настольные автоклавы на 18–24 л подходят для малых лабораторий и для отдельной задачи — например, стерилизации наконечников или небольших партий сред. Вертикальные на 35–150 л — основной прибор бактериологической лаборатории среднего масштаба: в них удобно ставить корзины с флаконами и лотки с отходами. Горизонтальные на сотни литров с тележкой и стеллажами — для крупных лабораторий, централизованных автоклавных и производства сред. Виды автоклавов и их особенности сравниваются в статье виды автоклавов для стерилизации; ассортимент — в разделах вертикальные автоклавы и настольные и портативные автоклавы.

Удаление воздуха и сушка

Если в лаборатории стерилизуют только среды и открытую посуду, достаточно гравитационного вытеснения воздуха и сушки без вакуума. Если есть упакованные наконечники, ткань, фильтры и плотные пакеты с отходами, нужен импульсный вакуум и вакуумная сушка. Среди вертикальных моделей с вакуумом — КАДАММ СП-В34, КАДАММ СП-В31, КАДАММ СП-В32, КАДАММ СП-В33 и КАДАММ СП-В36 с подъёмом камеры для удобной выгрузки тяжёлых корзин; среди настольных — серии класса B, например КАДАММ СП-Н12 на 18–24 л и КАДАММ СП-Н15 на 60–80 л.

Программы и управление

Для микробиологии важны: регулируемая температура стерилизации (не только 121 и 134 °C), отдельная программа для жидкостей, задаваемое время выдержки и сушки, память программ и запись параметров цикла. У КАДАММ СП-В30 температура стерилизации задаётся в диапазоне 105–143 °C, а в памяти 88 программ — удобно, когда разные среды и загрузки требуют разных режимов. У КАДАММ СП-В20 с откидной крышкой время стерилизации задаётся от 1 до 6000 мин. Точность регулирования 0,1 °C у многих вертикальных серий, например КАДАММ СП-В9, КАДАММ СП-В27 и КАДАММ СП-В28, помогает держать щадящие режимы для сред без перегрева.

Безопасность оператора

В лаборатории автоклав загружают лаборанты, поэтому важны блокировка двери под давлением, предохранительный клапан, защита от перегрева и работы без воды, понятная индикация завершения цикла. При работе с жидкостями — охлаждение до безопасной температуры перед открытием. При работе с отходами — сбор конденсата и фильтрация выхлопа. Комплект защит конкретной модели указан в её карточке; если нужной строки там нет — уточняйте у менеджера.

Контроль стерилизации и журнал

Ни чистый, ни грязный автоклав нельзя считать работающим только потому, что на дисплее отображается нужная температура. Контроль стерилизации в лаборатории складывается из трёх уровней: физического (температура, давление, время по показаниям прибора и записи цикла), химического (индикаторы, меняющие цвет при достижении условий стерилизации) и биологического (индикаторы со спорами термоустойчивых микроорганизмов). Классификацию химических индикаторов устанавливает ГОСТ ISO 11140-1; для паровой стерилизации в качестве биологического индикатора используют споры Geobacillus stearothermophilus.

Что контролировать в микробиологии

Для сред — контроль стерильности самой партии: часть флаконов или чашек выдерживают в термостате и проверяют на отсутствие роста, а ростовые свойства подтверждают контрольными штаммами. Для упакованных изделий в автоклаве с вакуумом — ежедневный тест на удаление воздуха (тест Боуи — Дика) и химические индикаторы внутри упаковок. Для отходов — индикаторы в центре самого плотного пакета: именно там пар появляется последним. Каждый цикл записывают в журнал: дата, программа, загрузка, оператор, результат индикаторов. Подробно о видах контроля и ведении журнала — в статье контроль качества стерилизации в автоклаве.

Валидация программ

Программы для типовых загрузок — бутыли со средой, пакеты с отходами, штативы с наконечниками — стоит один раз проверить термометрией: разложить датчики в самых трудных местах загрузки и убедиться, что время выдержки при нужной температуре набирается везде. Это особенно важно для грязного автоклава: недообработанный пакет с культурами опаснее, чем нестерильная среда. О квалификации и термометрии камеры — в статье валидация автоклава.

Типовой комплект для микробиологической лаборатории

Автоклав работает в связке с другим оборудованием: без бокса микробиологической безопасности нельзя разливать среды и сеять пробы, без инкубаторов — выращивать культуры, без сушильного шкафа — быстро готовить посуду. Ниже — типовые наборы для трёх масштабов работы. Это ориентир для первого разговора с нашими инженерами, а не готовый проект: точный состав зависит от методик, числа исследований и помещения.

Небольшая лаборатория или санитарная лаборатория предприятия

Лаборатория на одну-две комнаты, где готовят немного сред и выполняют рутинные посевы. Один настольный автоклав с регулировкой температуры для сред и посуды, разделение чистых и грязных циклов по времени; если отходов много — второй, небольшой вертикальный автоклав для обеззараживания. Для небольших объёмов подходят портативные КАДАММ СП-П2 и КАДАММ СП-П3 с регулировкой температуры (105–127 °C и 105–126 °C), настольные класса N — КАДАММ СП-Н7 на 45 л с сушкой.

Бактериологическая лаборатория среднего масштаба

Отдельная зона приготовления сред и автоклавная. Чистый вертикальный автоклав с вакуумом и программой для жидкостей — КАДАММ СП-В34 на 50–150 л или КАДАММ СП-В13 с низкими уставками для агара; грязный вертикальный со сбором конденсата и фильтрацией выхлопа — КАДАММ СП-В35. Работа с культурами — в боксах микробиологической безопасности II класса, выращивание — в инкубаторах для культивирования микроорганизмов; для капнофильных бактерий — в CO₂-инкубаторах. Чем различаются классы боксов, рассказано в статье классы ламинарных боксов и БМБ.

Крупная лаборатория и централизованная автоклавная

Несколько отделов, своё производство сред, барьерная зона. Горизонтальные автоклавы с вакуумной сушкой и тележками — КАДАММ СП-Г9 или КАДАММ СП-Г12; для выноса материала из барьерной зоны — проходной КАДАММ СП-Г24 или КАДАММ СП-Г26; при наличии централизованного пара — модели от внешнего пара. Для хранения музейных культур — лиофильные сушилки; о сохранении бактерий лиофилизацией — в статье лиофилизация бактерий, плазмы и биопрепаратов.

При оснащении стоит заложить и средства на случай аварии: попадание культуры или горячей жидкости на кожу и в глаза требует немедленного промывания, поэтому рядом с автоклавной и зоной работы с культурами ставят аварийные души и фонтаны для промывки глаз. Реактивы для приготовления сред и дезинфицирующие растворы хранят в шкафах для хранения реактивов.

Модели КАДАММ в каталоге — лабораторное оборудование для стерилизации сред, посуды и обеззараживания отходов. Для стерилизации изделий, которые применяют у людей, нужен стерилизатор с регистрационным удостоверением; эта тема разобрана в статье о требованиях к стерилизаторам для здравоохранения.