Зачем средам автоклав
Питательная среда создана для роста микроорганизмов, поэтому любая занесённая спора в ней прорастёт. Сухие компоненты, вода, посуда и пробки несут микрофлору, в том числе споры бацилл и клостридий, которые переживают кипячение. Убивает их только насыщенный пар под давлением: при 121 °C он отдаёт скрытую теплоту конденсации и прогревает жидкость до температуры, при которой споры гибнут за минуты. Поэтому стерилизация питательных сред в лаборатории — это почти всегда паровая стерилизация в автоклаве.
Исключения есть: растворы с термолабильными компонентами (антибиотики, часть витаминов, сыворотка, мочевина) стерилизуют фильтрованием через мембрану и добавляют в уже простерилизованную и остывшую основу. Остальное — бульоны, агаризованные среды, разбавители, физиологический раствор — проходит через автоклав. Общий порядок приготовления и контроля сред для пищевой микробиологии описывает ГОСТ ISO 11133; в первую очередь смотрите инструкцию производителя конкретной сухой среды: там указаны режим и допустимое время.
Подготовка сред к автоклавированию
Растворение и pH
Сухую среду полностью растворяют в воде нужного качества. Агаризованные среды доводят до кипения при перемешивании, пока агар не растворится целиком: нерастворённые хлопья в автоклаве не разойдутся равномерно и дадут неоднородный гель. pH проверяют до стерилизации, учитывая, что после нагрева он обычно немного смещается; допуск указан в инструкции к среде.
Посуда и укупорка
- Ёмкости заполняют не больше чем на две трети: жидкость расширяется при нагреве и вскипает при сбросе давления.
- Крышки флаконов откручивают на пол-оборота или ставят ватно-марлевые и силиконовые пробки, пропускающие пар. Плотно закрытая бутыль — это сосуд под давлением, внутри которого нет пара, а при охлаждении она может лопнуть.
- Горлышки пробок и ватные пробки накрывают фольгой или крафт-бумагой, чтобы после цикла конденсат не смочил пробку.
- Разливают сразу порциями под задачу: десять флаконов по 250 мл стерилизуются быстрее и надёжнее одной бутыли на 2,5 л.
Не стерилизуйте среды в герметично закрытых ёмкостях и в посуде с трещинами. Перегретая жидкость в закрытой бутыли при открытии двери вскипает мгновенно: это прямая причина ожогов при работе с автоклавом.
Режим и время выдержки
Для большинства сред режим — 121 °C. Типовое время из инструкций к сухим средам — 15 мин, но оно относится к небольшим объёмам: пробиркам и флаконам. Время выдержки отсчитывают с момента, когда температуру набрала сама жидкость, а не камера. Датчик автоклава стоит в камере или в сливе и показывает температуру пара; литровая бутыль в это время ещё заметно холоднее. Поэтому для крупных ёмкостей время увеличивают и подтверждают контрольным датчиком, опущенным в эталонную ёмкость с водой того же объёма.
Щадящие режимы
Среды с сахарами (лактозой, глюкозой), желчью или яичным желтком часто стерилизуют при пониженной температуре — например, 115 °C или 110–112 °C, — либо дробно текучим паром. Это снижает реакцию Майяра между сахарами и аминокислотами: среда темнеет меньше, ростовые свойства сохраняются. Конкретный режим берите из инструкции к среде, а не подбирайте на глаз: заниженная температура без увеличения времени даёт нестерильную среду.
Почему не 134 °C
Режим 134 °C с короткой выдержкой хорош для стекла и металла, но для жидкостей его не используют: внешние слои перегреваются, пока центр ёмкости ещё догоняет, а сброс давления с такой температуры опаснее. Подробно о связи температуры, давления и времени — в статье «Режимы стерилизации в автоклаве».
| Загрузка | Режим | На что обратить внимание |
|---|---|---|
| Бульоны, разбавители в пробирках и малых флаконах | 121 °C, время по инструкции к среде | Пробки, пропускающие пар; штатив, а не плотный пакет |
| Агаризованные среды во флаконах | 121 °C, время по объёму ёмкости | Агар растворить заранее; после цикла держать тёплым до разлива |
| Среды с сахарами, желчью, яичными добавками | Пониженная температура по инструкции | Не превышать время; добавки вносить после остывания |
| Крупные бутыли | 121 °C, удлинённая выдержка | Время подтвердить датчиком в эталонной ёмкости |
| Термолабильные добавки | Без автоклава | Фильтрование через мембрану, внесение в остывшую основу |
Загрузка камеры
Пар должен свободно обтекать каждую ёмкость. Флаконы ставят в сетчатые корзины с зазорами, не прижимая к стенкам камеры; пробирки — в металлические штативы. Ёмкости одного объёма собирают в одну загрузку: если в камере вместе пробирки и литровые бутыли, время придётся считать по бутылям, и пробирки перегреются. Под стеклянную посуду ставят поддон: при сбое укупорки среда не попадёт на ТЭН и в слив.
Отходы с посевами и чистые среды в одном цикле не стерилизуют. Для обеззараживания отработанных чашек нужен свой режим и своя загрузка, об этом — в статье «Обеззараживание лабораторных отходов в автоклаве».
Сброс давления и охлаждение
В конце выдержки жидкость перегрета относительно атмосферного давления. Если сбросить пар быстро, она закипает во всём объёме: выбивает пробки, выплёскивается и теряет воду, а концентрация среды меняется. Поэтому у автоклавов для сред есть программа для жидкостей: давление снижается медленно, а дверь или крышка блокируется, пока температура в камере не опустится до безопасной.
Сушка средам не нужна: она лишь продлевает нагрев и выпаривает воду. В автоклавах с вакуумной сушкой для жидкостей выбирают программу без сушки и без глубокого вакуума на этапе охлаждения. Вакуумная сушка нужна для упакованного стекла, пробок и инструментов, которые вы стерилизуете в другом цикле.
Открывайте камеру только после того, как давление упало до нуля, а температура опустилась до безопасной по инструкции к автоклаву. Работайте в термостойких перчатках и защитном щитке: стекло со средой остаётся горячим ещё долго после окончания цикла.
Агар: растапливание и выдержка тёплым до разлива
Агаризованную среду разливают в чашки, когда она остыла примерно до 45–50 °C: горячее — на крышках чашек собирается конденсат, холоднее — среда начинает застывать в бутыли. Добавки (антибиотики, кровь, эмульсию желтка) вносят в этот же момент. Удобнее всего, когда сам автоклав после цикла переходит в режим поддержания температуры и держит флаконы тёплыми до разлива, — тогда водяная баня не нужна.
Стерильность среды легко потерять на разливе. Чашки заливают в ламинарном боксе, где над рабочей зоной идёт поток воздуха через HEPA-фильтр (оборудование — в разделе «Ламинарные боксы и шкафы»). Как подготовить бокс и в каком порядке работать — в статье «Правила работы в ламинарном боксе».
Тот же приём используют, чтобы растопить застывший агар перед разливом: флакон прогревают в автоклаве при температуре ниже стерилизационной. Для этого у автоклава должна быть низкая нижняя граница уставки. Наличие отдельной программы растапливания и поддержания температуры у конкретной модели уточняйте у менеджера.
Типичные ошибки
- Одинаковое время для любых объёмов. Пробирки перегреваются, бутыли недогреваются.
- Плотно закрученные крышки. Внутри ёмкости нет пара, а при открытии — вскипание и риск разрушения стекла.
- Быстрый сброс давления. Потеря объёма, выбитые пробки, загрязнённая камера.
- Повторное автоклавирование. Каждый лишний цикл темнит среду и снижает её ростовые свойства; застывший агар растапливают, а не стерилизуют заново.
- Среды вместе с отходами. Разные режимы и риск перекрёстного загрязнения.
- Добавки в горячую основу. Термолабильные компоненты разрушаются, кровь гемолизируется.
Контроль стерильности сред
Режим автоклава подтверждают индикаторами: химические показывают, что в месте закладки были нужные температура и время, биологические — что погибли споры тест-культуры. Для сред индикатор кладут в эталонную ёмкость, а не на корзину. Готовую партию проверяют выборочной инкубацией без посева в термостате (см. раздел «Инкубаторы для культивирования микроорганизмов»): среда должна остаться стерильной. Ростовые свойства проверяют контрольными штаммами. Как вести контроль и журнал — в статье «Контроль качества стерилизации в автоклаве».
Какой автоклав выбрать для стерилизации питательных сред
Автоклав для стерилизации питательных сред выбирают по трём признакам: точная температура и равномерность по камере, программа для жидкостей с управляемым охлаждением и удобная загрузка флаконов. В каталоге КАДАММ для этой задачи чаще всего берут вертикальные модели: флаконы и бутыли ставят в корзины сверху, камера заполняется по высоте.
- Вертикальный с программами сред и вакуумной сушкой. КАДАММ СП-В34 — камеры 50–150 л, температура стерилизации 105–136 °C, равномерность ±0,5 °C, предельный вакуум −0,096 МПа. Для сред — программа для жидкостей, для стекла и пробок — цикл с вакуумной сушкой в том же приборе.
- Низкие уставки для агара. КАДАММ СП-В13 (60–120 л) настраивается от 40 до 138 °C, КАДАММ СП-В6 с откидной крышкой (40–80 л) — от 50 до 134 °C, время стерилизации до 9999 мин. Такой диапазон позволяет растапливать агар и работать щадящими режимами.
- Много сред — много программ. КАДАММ СП-В30 (65–115 л) хранит 88 программ в памяти: под каждую среду и объём ёмкости — своя.
- Малые объёмы. Портативные КАДАММ СП-П1 (18 и 24 л) работают с фиксированной температурой 126 °C; их хватает для разбавителей и небольших партий в пробирках, но для сред с сахарами нужен прибор с регулируемой температурой, например КАДАММ СП-П3 с установкой 105–126 °C.
- Большие партии. Для потоковой подготовки сред — горизонтальные автоклавы, например КАДАММ СП-Г2 на 150–400 л с режимами 121 / 134 °C.
Все вертикальные модели собраны в разделе «Вертикальные автоклавы», компактные — в разделе «Настольные и портативные автоклавы», крупные — в разделе «Горизонтальные автоклавы». Общий обзор — «Автоклавы (паровые стерилизаторы)».
Сообщите, какие среды и в каких ёмкостях вы готовите и сколько литров в сутки, — наши инженеры подберут объём камеры, программы для жидкостей и поддержание температуры для агара.